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[實(shí)驗(yàn)原理]

    大腸桿菌是含有長(zhǎng)約3000Kb的環(huán)狀染色體的棒狀細(xì)菌，它能在僅含碳水化合物（如葡萄糖，提供碳源和能量）和提供氮、磷、微量元素的無(wú)機(jī)鹽的極限培養(yǎng)基上快速生長(zhǎng)。如果用含氨基酸、核苷酸前體、維生素以及其它一些細(xì)菌不能合成的代謝成分的豐富培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)，那么大腸桿菌會(huì)生長(zhǎng)的更快。大多數(shù)應(yīng)用于DNA重組技術(shù)的細(xì)菌是大腸桿菌K-12株的衍生菌株。

    當(dāng)大腸桿菌在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，其開(kāi)始裂殖前，先進(jìn)入一個(gè)生長(zhǎng)滯后期。在豐富培養(yǎng)基中，它能在20-30min內(nèi)復(fù)制一代，這種指數(shù)生長(zhǎng)相稱之為對(duì)數(shù)期。zui后，當(dāng)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分和氧耗盡或當(dāng)培養(yǎng)基中廢物的含量達(dá)到抑制細(xì)菌的快速生長(zhǎng)的濃度時(shí)，菌體密度就達(dá)到一個(gè)比較恒定的值。在通常的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)中，在這一時(shí)期的細(xì)胞密度一般為1*109—2*109ml，細(xì)胞停止迅速分裂。這就是細(xì)菌生長(zhǎng)的飽和期，而所謂的新鮮飽和即指當(dāng)培養(yǎng)液中細(xì)胞密度剛到達(dá)這一水平。

    培養(yǎng)特征是指微生物在培養(yǎng)基上所表現(xiàn)的群體形態(tài)和生長(zhǎng)情況。細(xì)菌培養(yǎng)特征的常規(guī)檢驗(yàn)包括平面上的菌落特征，液體培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)特征以及斜面培養(yǎng)上的菌苔特征。菌落是個(gè)體微生物在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖成的肉眼可見(jiàn)的群落。在一定的培養(yǎng)條件下，不同的細(xì)菌形成的菌落形狀是不一樣的。

[儀器、材料與試劑]

(一) 儀器和材料

    超凈工作臺(tái)酒精燈 無(wú)菌培養(yǎng)皿及試管 接種環(huán) 無(wú)菌牙簽 涂布棒DH5α菌株

(二) 試劑

    LB液體培養(yǎng)基：每升含10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCL、1mL 1M NaOH

    LB固體培養(yǎng)基：每升含10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCL、1mL 1M NaOH、15g瓊脂糖

[實(shí)驗(yàn)步驟]

（一） 在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)

    將已熔化的LB固體培養(yǎng)基冷涼到50℃左右（即熱而不燙手），按無(wú)菌操作倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，冷卻凝固成平板，將涂布棒的三角部分浸沒(méi)于酒精中，取出后再通過(guò)燈焰，點(diǎn)燃其上的乙醇，待涂布棒上的火焰熄滅后，將其觸碰無(wú)菌瓊脂平板的表面使其冷卻。然后，取少許菌液（100uL）滴在平板上，用涂布棒作圓周運(yùn)動(dòng)將菌液涂布均勻，待平板干后于37℃倒置培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)出后，觀察菌落特征

（二） 在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)

    取5mL液體培養(yǎng)基加入一支無(wú)菌試管中，用無(wú)菌牙簽挑一個(gè)單菌落浸沒(méi)于培養(yǎng)液中并輕輕振動(dòng)，使待接種的細(xì)菌分散在培養(yǎng)液中，蓋好試管，在搖床上以60r/min于37℃培養(yǎng)至飽和（約6h），觀察液體培養(yǎng)物是否混濁。利用分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)，按每0.1 OD值大約相當(dāng)于108細(xì)胞/mL計(jì)算細(xì)菌濃度。